RNA Therapeutics: επισκόπηση και μελλοντικές προοπτικές

Για πολλά χρόνια οι φαρμακευτικές εταιρείες βασίζονται στην θεραπευτική χρήση μικρών μορίων για την παραγωγή φαρμάκων. Αυτά τα μικρά μόρια συνδέονται με πρωτεΐνες-στόχους, όπως ένζυμα, υποδοχείς ή άλλες πρωτεΐνες. Με αυτόν τον τρόπο παρεμβαίνουν σε μια ορισμένη βιολογική διαδικασία που καταλήγει σε θεραπευτικό αποτέλεσμα.  Υπολογίζεται ότι από τις περίπου 20.000 ανθρώπινες πρωτεΐνες, μόνο οι 3.000 μπορούν είτε να αλληλεπιδράσουν με φάρμακα είτε να αποτελέσουν στόχο φαρμάκων. Για να αξιοποιηθεί το ανεξερεύνητο πρωτεϊνικό δυναμικό, πρέπει να κανείς να αναζητήσει πέρα ​​από τα μικρά φαρμακευτικά μόρια. Επομένως για να  αναπτυχθούν πιο εξειδικευμένα και αποτελεσματικά φάρμακα, μια νέα θεραπευτική μέθοδος κερδίζει έδαφος: η θεραπεία με βάση τα νουκλεϊκά οξέα και πιο συγκεκριμένα με βάση το RNA.

Τύποι Θεραπευτικών RNA

1. Αντινοηματικά Ολιγονουκλεοτίδια (ASOs)

Τα αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια ή ASOs είναι βραχέα, μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια, συμπληρωματικά ενός mRNA στόχου, με τον οποίο υβριδοποιούνται. Με αυτό τον τρόπο ρυθμίζουν την έκφραση της αντίστοιχης πρωτεΐνης. Τα ASO μπορούν να αποτελούνται τόσο από αζωτούχες βάσεις DNA όσο και RNA.

Τα κλασικά ASOs βασίζονται στο DNA και δρουν με το σχηματισμό υβριδίων DNA-RNA, που αποτελούν υπόστρωμα για τη RNαση H, η οποία τα αποικοδομεί. Ωστόσο, υπάρχουν και άλλες λειτουργίες που μπορούν να επιτελέσουν τα ASOs, γεγονός που ανοίγει δρόμους για τα ASOs βασισμένα σε RNA.

Για παράδειγμα, τα ASOs μπορούν να υβριδοποιηθούν σε θέση κοντά στο κωδικόνιο έναρξης και έτσι να παρεμβαίνουν στερεοχημικά στη μετάφραση ή να υβριδοποιηθούν σε μη μεταφρασμένες περιοχές και να παρεμποδίζουν πάλι στερεοχημικά τις πρωτεΐνες που δεσμεύουν το RNA. Με αυτό τον τρόπο μπορούν να διακόψουν τη μεταφραστική διαδικασία.

Εκτός από την αναστολή της μετάφρασης, τα ASOs μπορούν επίσης να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα μετάφρασης της πρωτεΐνης στόχου. Τα ASOs για να το πετύχουν αυτό, μπορούν να αναστείλουν στερεοχημικά τη μετάφραση ενός ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης σε ανώτερο σημείο και εναλλακτικά μπορούν να τροποποιήσουν το μάτισμα μέσω δέσμευσης σε υπάρχουσες θέσεις ματίσματος ή σε σημεία που σηματοδοτούν τη δημιουργία εξωνίων ή ιντρονίων.

2. siRNA και miRNA

Τα siRNA (short interfering RNA) είναι μικρά, δίκλωνα μόρια RNA που χρησιμοποιούν το μονοπάτι RNAi για να αποικοδομήσουν ένα mRNA στόχο. Ο τρόπος αποσύνθεσης είναι ειδικός για την εκάστοτε αλληλουχία.

Το μονοπάτι RNAi ή RNA interference πυροδοτείται από τμήματα RNA. Αυτά οδηγούν στο σχηματισμό ενός συμπλέγματος ενζύμων και RNA. Το μικρό μονόκλωνο τμήμα RNA μπορεί και καθοδηγεί το σύμπλεγμα στο συμπληρωματικό του τμήμα σε ένα μόριο mRNA, παρεμποδίζοντας τελικά τη μετάφρασή του.

Ένας άλλος τύπος RNA που χρησιμοποιεί την οδό RNAi είναι τα μιμητικά miRNA (micro RNA). Τα μιμητικά miRNA είναι συνθετικά, δίκλωνα RNA που μιμούνται ένα φυσικώς απαντώμενο miRNA. Αυτά τα μιμητικά μόρια μπορούν να αναπληρώσουν την μεταβλημένη λειτουργικότητα των miRNA σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως σε κάποιες μορφές καρκίνου.

3. mRNA

Η ιδέα της επιμόλυνσης κυττάρων με mRNA αντί για DNA υπάρχει εδώ και μερικές δεκαετίες. Το mRNA θεωρείται ασφαλέστερη εναλλακτική για θεραπευτικούς σκοπούς, καθώς αποικοδομείται γρήγορα και δεν προκαλεί ανησυχίες για πιθανές δυσμενείς επιπτώσεις. Αυτές αφορούν το DNA και  μπορεί να προέρχονται από την μακροχρόνια έκφρασή του ή από την ενσωμάτωση σε κάποιο γονίδιο.

Ωστόσο, η έκφραση του mRNA είναι πιο δύσκολο να ρυθμιστεί από την έκφραση του DNA. Στην περίπτωση αυτή πιθανή τοξικότητα μπορεί να προκύψει από την έκφραση του mRNA σε θέσεις εκτός του στόχου, οδηγώντας σε ανεπιθύμητη έκφραση πρωτεΐνης.

4. RNA Απταμερή

Τα απταμερή είναι βραχέα μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια που μπορούν να αποτελούνται τόσο από DNA όσο και από RNA. Δημιουργήθηκαν για πρώτη φορά το 1990 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX). Με τη μέθοδο αυτή βρίσκονται κατάλληλα ολιγονουκλεοτίδια για πρόσδεση με ένα μόριο στόχο.

Χρησιμοποιώντας το SELEX, επιλέγονται RNA απταμερή από βιβλιοθήκες, τα οποία δεσμεύουν επιλεκτικά μικρούς μοριακούς στόχους ή πρωτεΐνες με υψηλή συγγένεια και υψηλή ειδικότητα.

Μέχρι σήμερα, μόνο ένα RNA απταμερές έχει λάβει έγκριση από τον FDA, η πεγκαπτανίμπη. Η πεγκαπτανίμπη δεσμεύεται στον αυξητικό παράγοντα VEGF και χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της σχετιζόμενης με την ηλικία εκφύλισης της ωχράς κηλίδας.

Εκτός από το θεραπευτικό δυναμικό τους τα απταμερή χρησιμοποιούνται επίσης αποκλειστικά ως αρωγοί στη στόχευση και μεταφορά άλλων θεραπευτικών RNA τμημάτων, όπως siRNA.

5. saRNA

Τα saRNA είναι δίκλωνα, μη κωδικοποιητικά RNA που διαθέτουν δύο προεξοχές από νουκλεοτίδια στα δύο άκρα. Τα saRNAs συνδέονται με μία πρωτεΐνη και το σύμπλεγμα εισέρχεται στον πυρήνα. Εκεί, προσδένεται  στους υποκινητές των γονιδίων στόχων και ενισχύει τη μεταγραφή.

6. gRNA για CRISPR/Cas9-Directed Knockout

Η ανάπτυξη της τεχνολογίας επεξεργασίας γονιδίων CRISPR-Cas9 ώθησε περαιτέρω την ανάπτυξη των θεραπευτικών RNA στο προσκήνιο. Η κωδικοποίηση του mRNA της πρωτεΐνης Cas9 και διάφορων sgRNA (single guide RNA) έναντι ενός συγκεκριμένου γονιδιακού στόχου, έχει πολλά υποσχόμενες εφαρμογές για στρατηγικές εξουδετέρωσης γονιδίων.

Χημικές τροποποιήσεις στα μόρια RNA

Μερικά από τα κύρια εμπόδια στη θεραπεία RNA είναι:

• η ασταθής φύση των μορίων, λόγω της υψηλής σταθερότητας και δραστηριότητας των RNασων,
• η υψηλή ανοσογονικότητα των μορίων RNA. Τόσο τα μονόκλωνα όσο και τα δίκλωνα μόρια RNA επάγουν την παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι και άλλων κυτταροκινών μέσω πολλαπλών μονοπατιών σηματοδότησης.

Επομένως, απαιτούνται χημικές τροποποιήσεις των μορίων RNA για να μπορούν να εφαρμοστούν RNA θεραπευτικές τακτικές στην κλινική πράξη. Τέτοιες τροποποιήσεις μπορεί να περιλαμβάνουν:

• μεταβολές στη ριβόζη,
• μεταβολές στο φωσφορικό σκελετό,
• τροποποίηση των άκρων στα RNA μόρια,
• τροποποίηση των ίδιων των βάσεων.

Επιπλέον, τα άκρα του RNA είναι ευάλωτα σε εξωνουκλεάσες, άρα η προστασία τους είναι εξίσου σημαντική. Αυτό επιτυγχάνεται με τροποποίηση της βάσης θυμιδίνης στο 3′ άκρο, την προσθήκη παλμιτικού οξέος και με την ομοιοπολική σύνδεση αρωματικών ενώσεων στο 5′ άκρο σε siRNAs.

Χορήγηση Θεραπευτικών RNA

Η κύρια πρόκληση στη θεραπευτική RNA είναι η παροχή και οι δυσκολίες στην ενδοκυτταρική πρόσληψη μορίων RNA. Αυτό συμβαίνει εξαιτίας του μεγάλου μοριακού βάρους και του αρνητικά φορτισμένου φωσφορικού σκελετού που εμποδίζει την εσωτερίκευση.

Ενώ οι χημικές τροποποιήσεις στα μόρια RNA αυξάνουν δραματικά τη σταθερότητα και μειώνουν την ανοσογονικότητα, η ενδοφλέβια έγχυση γυμνού RNA παραμένει μία πρόκληση διότι πολλαπλοί φραγμοί εμποδίζουν την πρόσληψή του.

Μερικά από τα εμπόδια είναι:

• οι κυτταρικοί φραγμοί
• το μονοπύρηνο σύστημα φαγοκυττάρων (MPS), το οποίο καθαρίζει αποτελεσματικά τα χορηγούμενα σωματίδια μέσω της φαγοκυττάρωσης
• το μικρό μέγεθος των μορίων RNA. Ένα μειονέκτημα του μικρού μεγέθους των μορίων είναι ο αυξημένος ρυθμός κάθαρσης από τους νεφρούς και αυτό είναι και το μεγαλύτερο εμπόδιο στην ενδοφλέβια χορήγηση γυμνού RNA.

Ευτυχώς με τροποποιήσεις του φωσφορικού σκελετού μειώνεται ο ρυθμός νεφρικής κάθαρσης των μορίων RNA γιατί αυξάνεται η δέσμευση με τις πρωτεΐνες του πλάσματος. Με αυτό τον τρόπο, αυξάνεται ο χρόνος ημιζωής του χορηγούμενου RNA στον ορό.

Η τοπική χορήγηση φαίνεται να είναι ο πιο βιώσιμος τρόπος παροχής γυμνού RNA μέχρι στιγμής. Παρόλα αυτά αναφέρονται διάφορες στρατηγικές χορήγησης που έχουν αναπτυχθεί για να επιτρέψουν την ασφαλή και αποτελεσματική χορήγηση θεραπευτικών RNA:

1. RNA συζευγμένο με τμήμα στόχευσης

Η προσάρτηση ενός ενεργού τμήματος στόχευσης στο RNA μπορεί να βοηθήσει τόσο στη στόχευση ιστού ή κυττάρου όσο και στην είσοδο των RNA σε συγκεκριμένα κύτταρα στόχους. Αν και δεν προστατεύει το RNA από την αποικοδόμηση, διευκολύνει τη συσσώρευση στο στόχο.

Σημαντικά χαρακτηριστικά του τμήματος στόχευσης είναι:

• η παρουσία ενεργών ομάδων για την επίτευξη της σύζευξης,
• η καλή συγγένεια σύνδεσης,
• η μειωμένη ανοσογονικότητα.

Τα αντισώματα είναι μια δημοφιλής επιλογή ως τμήματα στόχευσης λόγω της ειδικότητάς τους, της υψηλής συγγένειας, της καλά καθορισμένης δομής και του μεγάλου χρόνου κυκλοφορίας τους in vivo.

2. Απταμερή

Τα απταμερή έχουν χρησιμοποιηθεί για να κατευθύνουν θεραπευτικά μόρια RNA σε θέσεις στόχους. Όσον αφορά την ειδικότητα και τη συγγένεια, είναι παρόμοια με τα αντισώματα, αλλά είναι μικρότερα, έχουν υψηλότερη σταθερότητα και είναι ευκολότερο να παραχθούν.

3. Νανοσωματίδια λιπιδίων

Τα νανοσωματίδια λιπιδίων (LNPs) είναι πολύπλοκες, μεγάλες δομές που έχουν χρησιμοποιηθεί για την χορήγηση μεγάλων μορίων RNA (όπως το mRNA) in vivο. Τα LNPs μπορούν να ενθυλακώσουν μεγάλες ποσότητες RNA και να τα προστατεύσουν τόσο από την ενζυμική αποικοδόμηση όσο και από τη νεφρική κάθαρση.

Η προσθήκη λιπιδίων με πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει τον χρόνο κυκλοφορίας του λιπιδικού νανοσωματιδίου. Ο λόγος είναι ο στερεοχημικός φραγμός που δημιουργείται γύρω από την επιφάνεια του LNP που το προστατεύει από αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες πλάσματος.

Στην πραγματικότητα, η χρήση των PEG-λιπιδίων είναι πλέον πρότυπη αφού χρειάζεται στα νέα συστήματα ανάμιξης για να καθίσταται δυνατή η αυτοσυναρμολόγηση. Ωστόσο, υπάρχει και το μειονέκτημα ότι ο φραγμός αναστέλλει τις αλληλεπιδράσεις με την κυτταρική μεμβράνη με αποτέλεσμα την διαφυγή του θεραπευτικού RNA. Επομένως, ο ακριβής συντονισμός της ποσότητας του PEG-λιπιδίου και του μήκους της αλυσίδας PEG είναι καθοριστικός.

4. Πολυμερή

Τα κατιονικά πολυμερή είναι κατάλληλα για την παροχή RNA λόγω του θετικού φορτίου, της χημικής ποικιλομορφίας και της συμβατότητάς τους με διάφορα τμήματα στόχευσης.

Η ευελιξία των μορίων RNA τα καθιστά δημοφιλείς θεραπευτικούς παράγοντες για ένα ευρύ φάσμα ιατρικών καταστάσεων. Ωστόσο, τα προβλήματα χορήγησης έχουν επιβραδύνει το πεδίο για πολλά χρόνια. Ωστόσο, υπάρχει ακόμη πολλή δουλειά που πρέπει να γίνει για να επιτευχθεί αποτελεσματική θεραπεία με RNA. Ο τομέας της θεραπευτικής RNA έχει δει σημαντικές εξελίξεις σε πολλαπλά επίπεδα και μια μεγάλη ποικιλία διαφορετικών μορίων RNA βρίσκονται επί του παρόντος σε διαφορετικά στάδια προ-κλινικής ανάπτυξης. Χάρη στις μεγάλες αυτές προσπάθειες, οι θεραπευτικές RNA μετατράπηκαν από ένα μη ρεαλιστικό όνειρο σε γνήσια πραγματικότητα, έτοιμη για το επόμενο επίπεδο.

Πηγή: Cell