CRISPR/CAS9: Το θεραπευτικό εργαλείο του μέλλοντος

Το σύστημα CRISPR/CAS9 ή «Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR Associated Proteins» είναι μια νέα τεχνολογία επεξεργασίας γονιδίων, η οποία επιτρέπει την πραγματοποίηση στοχευμένων αλλαγών στο DNA κυττάρων. Η τεχνολογία CRISPR/CAS9 έχει γεννήσει με αυτόν τον τρόπο την ελπίδα για τη θεραπεία γενετικών ασθενειών.  

Με άλλα λόγια, το σύστημα CRISPR/CAS9 είναι μια μέθοδος γονιδιακής θεραπείας, που επιτρέπει την επέμβαση στον γονότυπο ενός ανθρώπου. Ο σκοπός είναι η  ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση συγκεκριμένων γονιδίων που σχετίζονται  με ασθένειες. 

Σαν ιδέα προέκυψε από ένα κοινότυπο ερευνητικό πρόγραμμα που επιδίωκε την ανακάλυψη του τρόπου αντιμετώπισης των ιικών μολύνσεων στα βακτήρια. Μέσω του προγράμματος βρέθηκε ότι τα βακτήρια διαθέτουν ένα ευπροσάρμοστο ανοσοποιητικό σύστημα που λέγεται CRISPR. Το σύστημα αυτό εντοπίζει ιικό DNA και το καταστρέφει.

Τι είναι η CRISPR και το CAS9;

Η CRISPR είναι μια οικογένεια DNA ακολουθιών που βρίσκονται στο γονιδίωμα προκαρυωτικών οργανισμών, όπως βακτήρια και αρχαία. Αυτές οι ακολουθίες λαμβάνονται από κομμάτια DNA ιών-βακτηριοφάγων που είχαν προηγουμένως μολύνει έναν προκαρυώτη. Χρησιμοποιούνται για να εντοπίζουν και να καταστρέφουν DNA από όμοιους βακτηριοφάγους κατά την διάρκεια μολύνσεων. Για αυτό, αυτές οι ακολουθίες παίζουν ζωτικό ρόλο στο αντιιικό υπερασπιστικό σύστημα των βακτηριοφάγων και παρέχουν επίκτητη ανοσία.  

Το CAS9 είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιεί η CRISPR ακολουθία ως μέσο, το οποίο αναγνωρίζει και κόβει συγκεκριμένες ζώνες DNA. Οι ακολουθίες που κόβονται είναι συμπληρωματικές με την CRISPR ακολουθία. 

Τα μέρη του συστήματος:

Η CRISPR σε συνδυασμό με την CAS9 χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία γονιδίων μέσα στους οργανισμούς. Περιλαμβάνει συγκεκριμένες αλληλουχίες: 

• REPEATS: επαναλαμβανόμενες παλινδρομικές  αλληλουχίες  DNA μήκους 21-47 ζευγών βάσεων.
• SPACERS: αλληλουχίες DNA που παρεμβάλλονται μεταξύ των repeats και αποτελούν τμήματα από το γενετικό υλικό βακτηριοφάγων που έχουν μολύνει το βακτήριο.  
• CAS ΤΜΗΜΑΤΑ: γονίδια που κωδικοποιούν cas πρωτεΐνες και είναι νουκλεάσες ή ελικάσες.
• LEADER: νουκλεοτιδική ακολουθία που περιέχει 200-350 ζεύγη βάσεων, είναι πλούσια σε αδενίνη και θυμίνη και αποτελεί τον υποκινητή της CRISPR συστοιχίας. 

Μηχανισμός δράσης:

Ο μηχανισμός δράσης της CRISPR/CAS9 περιλαμβάνει ορισμένα στάδια: 

1. Spacer acquisition: αυτό το στάδιο περιλαμβάνει την απόκτηση και ενσωμάτωση των τμημάτων DNA από τους ιικούς φάγους στο βακτηριακό γονιδίωμα και ειδικότερα στην CRISPR συστοιχία.                                                                                                                                    
2. crRNA processing: η ακολουθία του DNA υφίσταται μεταγραφή και ωρίμανση. Έτσι παράγεται το crisprRNA ή crRNA.                         
3. Interference and target degradation: περιλαμβάνει τη σύντηξη crRNA, που δημιουργήθηκε προηγουμένως, με την  CAS πρωτεΐνη.
4. Για την αναγνώριση του  στόχου είναι απαραίτητη η υβριδοποίηση του crRNA με την συμπληρωματική του αλληλουχία στο γονιδίωμα του ξένου DNA για να μπορέσει η πρωτεΐνη CAS9 να αναγνωρίσει μια αλληλουχία, την PAM (Protospacer Adjacent Motif). Η  PAM είναι μια μικρή αλληλουχία DNA (συνήθως με μήκος 2-6 ζεύγη βάσεων), που συμβάλλει στην διάσπαση μιας περιοχής του DNA που στοχεύει η CRISPR/CAS9.

Ακολουθώντας την παραπάνω διαδικασία, η CAS9 τελικά πετυχαίνει την αναγνώριση και την καταστροφή του στόχου της.    

Πως εφαρμόζεται η CRISPR/CAS9 στη θεραπεία ασθενειών;

Το πρώτο βήμα είναι να κοπεί η διπλή έλικα του  DNA από την CAS9 πρωτείνη. Προκειμένου η CAS9 να εντοπίσει το στόχο της, χρειάζεται επιπλέον βοηθό, το guide RNA ή gRNA, που καθοδηγεί την CAS9 σε συγκεκριμένη θέση στο γονιδίωμα. Το gRNA είναι έτσι κατασκευασμένο ώστε να ταιριάζει και να προσδένεται σε συγκεκριμένη αλληλουχία DNA. 

Μόλις δημιουργηθεί το σύμπλεγμα CAS9-guideRNA, μπορεί και εντοπίζει την ακολουθία PAM και προσδένεται σε αυτήν. Εκεί, το gRNA ξετυλίγει την διπλή έλικα για να καταφέρει στη συνέχεια το σύμπλεγμα CAS9-gRNA να αναγνωρίσει και να κόψει συγκεκριμένο κομμάτι DNA. 

Η κοπή του DNA πυροδοτεί έναν επιδιορθωτικό μηχανισμό για να επιδιορθώσει τη βλάβη. Υπάρχουν δυο είδη επιδιορθωτικών μηχανισμών: 

• HDR (Homology Directed Repair): επιδιορθωτικός μηχανισμός παρουσία προτύπου. Ο HDR μηχανισμός ενεργοποιείται όταν υπάρχει κάποια διαθέσιμη αλληλουχία DNA-καλούπι για να καθοδηγήσει την επιδιόρθωση και είναι πολύ ακριβής.
• NHEJ (Non-Homologous DNA End Joining): επιδιορθωτικός μηχανισμός απουσία προτύπου. Ο NHEJ μηχανισμός ακολουθείται όταν δεν υπάρχει αυτό το καλούπι και είναι πολύ πιο επιρρεπής σε λάθη. Μπορεί δηλαδή, να προκαλέσει προσθήκες ή ελλείψεις βάσεων οδηγώντας πιθανά σε πρόωρο τερματισμό ή σε αδρανοποίηση ενός γονιδίου.

Έτσι, καθίσταται δυνατή η προσθήκη ή απαλοιφή συγκεκριμένης ακολουθίας νουκλεοτιδίων, αλλά και η αντικατάσταση βάσεων με ιδιαίτερη ακρίβεια. Για την επεξεργασία του γονιδίου-στόχου, υπάρχουν διάφορα μονοπάτια.

Επεξεργασία γονιδίων με CRISPR/CAS9

• Απενεργοποίηση μιας ή και των δυο περιοχών κοπής της CAS9, έτσι ώστε να μην μπορεί να κόψει πια το DNA. Η CAS9 έπειτα συντήκεται με κάποιο άλλο ένζυμο επιλογής. Με αυτή τη μέθοδο, μεταφέρεται ένα ένζυμο με ακρίβεια στον επιθυμητό γενετικό τόπο. Παράδειγμα εφαρμογής αυτής της διαδικασίας είναι η σύντηξη της CAS9 με μία απαμινάση. Το ένζυμο αυτό μεταλλάσει τις βάσεις του DNA, αντικαθιστώντας την κυτοσίνη με θυμίνη. Μεταφέροντας την απαμινάση με το σύστημα CRISPR/CAS9 σε μία συγκεκριμένη περιοχή του DNA, επιτυγχάνεται μια επιθυμητή αλλαγή που μπορεί να μετατρέψει ένα μη λειτουγικό ή μειωμένης λειτουργικότητας γονίδιο σε φυσιολογικό.

• Απενεργοποίηση και των δυο περιοχών κοπής της CAS9 ώστε να μην κόβει το DNA, αλλά να οδηγεί σε σύντηξη με την ακολουθία στην οποία στοχεύει. Παράδειγμα εφαρμογής είναι η σύντηξη της απενεργοποιημένης CAS9 με έναν μεταγραφικό παράγοντα, για μεταφορά του με ακρίβεια στην επιθυμητή γενετική θέση. Ο μεταγραφικός παράγοντας μπορεί να διεγείρει την έκφραση γονιδίων, έλκοκντας ένζυμα και άλλους παράγοντες και αυξάνοντας τη μεταγραφή.

• Σύντηξη της CAS9 με αλληλουχίες krab. Αυτές μπορούν να στρατολογήσουν παράγοντες που συμμετέχουν φυσιολογικά στην απενεργοποίηση μεταγραφής των γονιδίων. Η περιοχή krab προσδένεται σε κάποιες πρωτεΐνες οι οποίες συμβάλλουν στην επαγωγή μεταγραφής ενός γονιδίου και τις αναστέλλουν. Με αυτό τον τρόπο, μία αλληλουχία krab μπορεί να αποκλείσει την έκφραση ενός γονιδίου. Καθίσταται δυνατός ο περιορισμός ή και η θανάτωση καρκινικών κυττάρων, οδηγώντας στην υποχώρηση όγκων και την καταπολέμηση της ασθένειας.

• Προσκόλληση φωσφοριζόντων πρωτεϊνών στην CAS9 για τον εντοπισμό της θέσης συγκεκριμένων αλληλουχιών σε ένα γονίδιο.

Από τη θεωρία στην πράξη

Η διόρθωση γενετικών ακολουθιών μπορεί να γίνει τόσο σε ένα ζυγωτό, όσο και σε κάποιο σωματικό κύτταρο. Υπάρχουν δυο τρόποι επεξεργασίας ενός γονιδίου:

• In vivo μέθοδος: επιδιόρθωση DNA μέσω CRISPR/CAS9 με ένεση των απαραίτητων συστατικών απευθείας στην κυκλοφορία του αίματος.
• Ex vivo μέθοδος: θεραπεία ασθενειών με επεξεργασία βλαστοκυττάρων ή προγεννητικών κυττάρων. Τα κύτταρα σε κάθε περίπτωση, λαμβάνονται από τον ασθενή και μεταμοσχεύονται με το πέρας της επεξεργασίας πάλι σε αυτόν.

Οι διαδικασίες αυτές ωστόσο, ενέχουν κάποιους κινδύνους. Υπάρχει η πιθανότητα να απορριφθούν τα μεταμοσχευμένα κύτταρα από τον οργανισμό ή με την ένεση ξένου φορέα να προκληθεί τοξικότητα. Λαμβάνεται υπόψη επιπλέον το γεγονός ότι χρειάζονται επαναλαμβανόμενες δόσεις θεραπείας. Μόνο έτσι θα διασφαλιστεί ο σωστός πληθυσμός κυττάρων για αλλαγή του φαινοτύπου.

Τέλος, είναι σημαντικό να επισημανθεί το γεγονός ότι με τη χρήση της τεχνολογίας CRISPR/CAS9, ανοίγει και ένα μεγάλο κεφάλαιο βιοηθικής. Με το σύστημα αυτό, δίνεται η δυνατότητα δημιουργίας ανθρώπων με συγκεκριμένα «επιθυμητά» εμφανισιακά γνωρίσματα ή με ενισχυμένα χαρακτηριστικά όπως τα γερά οστά ή άτομα που θα έχουν μικρότερη ευαισθησία σε καρδιαγγειακές παθήσεις.

Η CRISPR/CAS9 τεχνολογία μπορεί να λάβει πολύ διαφορετικές διαστάσεις και στην δημιουργία ανθρώπων «κατά παραγγελία». Είναι ευνόητο ότι όλες αυτές οι αλλαγές χαρακτηριστικών, αποτελούν σοβαρές παραβάσεις. Προτού οποιαδήποτε θεραπεία ή εφαρμογή εγκριθεί για ευρεία χρήση, είναι επιτακτικό όχι μόνο να συζητηθεί η πλευρά της βιοηθικής, αλλά να τεθούν περιορισμοί και υπεύθυνοι ελεγκτικοί μηχανισμοί. 

Πηγές: Human Molecular Genetics, Wiley Online Library