Προσδιορισμός του πολυπεπτιδικού σκελετού και των πλευρικών αλυσίδων της πρωτεΐνης H-NOX του βακτηρίου Nostoc sp. σε σύμπλοκο με το BAY 58-2667 (cinaciguat)

Τι είναι η διαλυτή γουανυλική κυκλάση;

Η διαλυτή γουανυλική κυκλάση (soluble Guanylate Cyclase, sGC) είναι ένα ετεροδιμερές ένζυμο το οποίο συμμετέχει στο σηματοδοτικό μονοπάτι “NO/sGC/cGMP”. Είναι ο μοναδικός υποδοχέας για το αέριο μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ), το οποίο προσδένεται στο μόριο της αίμης του H-NOX τομέα της sGC. Με τη σύνδεση αυτή πυροδοτείται μία σειρά διαμορφωτικών αλλαγών, οδηγώντας στη μετατροπή της τριφωσφορικής γουανοσίνης (GTP) σε κυκλική μονοφωσφορική γουανοσίνη (cGMP). 

Η απώλεια της αίμης της περιοχής H-NOX λόγω οξείδωσης του σιδήρου  και τα χαμηλά επίπεδα NO οδηγούν σε απώλεια της δραστικότητας του ενζύμου με συνέπεια καρδιαγγειακές παθήσεις, νευροεκφυλισμό και στυτική δυσλειτουργία. Για αυτό η sGC, και ειδικότερα ο H-NOX τομέας αποτελεί έναν πολύ ελκυστικό φαρμακευτικό στόχο, με σκοπό τη σύνθεση δραστικών ενώσεων έναντι του H-NOX τομέα. .

Έχουν βρεθεί δύο κατηγορίες χημικών ενώσεων που ενεργοποιούν την sGC απουσία ΝΟ: οι διεγέρτες και οι ενεργοποιητές. 

  • Διεγέρτες

Είναι ενώσεις αίμο-εξαρτώμενες και  προσδένονται πάνω στην ανηγμένη μορφή της sGC. Με αυτό τον τρόπο, ενισχύουν τη δράση της είτε απουσία του ΝΟ, είτε συνεργατικά με αυτό, όταν η βιοδιαθεσιμότητά του είναι χαμηλή. Ένα παράδειγμα διεγέρτη είναι το φάρμακο Riociguat (Adempas®), που χορηγείται για την πνευμονική υπέρταση.

  • Ενεργοποιητές:

Οι ενώσεις αυτές δρουν στην οξειδωμένη sGC ή στο heme-free ένζυμο, καταλαμβάνοντας την ίδια κοιλότητα πρόσδεσης με την αίμη , με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του ενζύμου. Παράδειγμα ενεργοποιητή είναι το πειραματικό φάρμακο Cinaciguat (BAY 58-2667).

Ο σκοπός της μελέτης:

Από προηγούμενες μελέτες μαγνητικού συντονισμού NMR, προσδιορίστηκε η δευτεροταγής δομή του H-NOX τομέα του κυανοβακτηρίου Nostoc sp. (Ns H-NOX) σε συνθήκες διαλύματος, αποδεικνύοντας ότι είναι μια πρωτεΐνη καλά αναδιπλωμένη με σταθερή δομή (1). Το συγκεκριμένο ομόλογο χρησιμοποιείται αντί της ανθρώπινης πρωτεΐνης λόγω του υψηλού ποσοστού ταυτοσημίας της αμινοξικής αλληλουχίας.

Σε συνέχεια των μελετών αυτών, προέκυψε η ανάγκη της NMR μελέτης του συμπλόκου της Ns H-NOX/Cinaciguat. Αν και η τριαδιάστατη δομή του συμπλόκου έχει προσδιοριστεί μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ, μέσω της φασματοσκοπίας NMR σε διάλυμα θα διερευνηθεί ο τρόπος και η ισχύς αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης με τη χημική ένωση, ενώ θα εξαχθούν και πληροφορίες για τη δυναμική συμπεριφορά του συμπλόκου.

Παρασκευή δειγμάτων προς ανάλυση:

Έκφραση και καθαρισμός της Ns H-NOX:

  1. Εισαγωγή μεταλλαγμένης πρωτεΐνης H-NOX σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης
  2. Μετασχηματισμός βακτηρίων με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια
  3. Καλλιέργεια βακτηρίων και έκφραση της Ns H-NOX
  4. Απομόνωση  και καθαρισμός της πρωτεΐνης με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και μοριακού αποκλεισμού

Για τη σύνθεση του συμπλόκου:

  1. Οξείδωση της αίμης: αντίδραση με περίσσεια οξειδωτικού παράγοντα
  2. Δημιουργία συμπλόκου: προσθήκη περίσσειας Cinaciguat
  3. Χρήση χρωματογραφίας μοριακού αποκλεισμού για καθαρισμό και απομόνωση του συμπλόκου 

Αποτελέσματα της ανάλυσης:

Η μελέτη αυτή αντικατοπτρίζει μια πρώτη προσπάθεια μελέτης της δομής της πρωτεΐνης H-NOX του Nostoc sp. σε σύμπλοκο με τον ενεργοποιητή  Cinaciguat σε συνθήκες διαλύματος οι οποίες προσομοιάζουν αρκετά το κυτταρικό περιβάλλον, χρησιμοποιώντας φασματοκοπία NMR. 

Το διδιάστατο φάσμα (1H-15N HSQC) του συμπλόκου Ns H-NOX/Cinaciguat αποδεικνύει το σχηματισμό μιας καλά αναδιπλωμένης πρωτεΐνης λόγω της διασποράς των σημάτων, με σταθερή δομή σε διάλυμα. Επίσης, με τη χρήση υπολογιστικού προγράμματος, βρέθηκε ότι το πρωτεϊνικό σύμπλοκο σχηματίζει 7 α-έλικες και 4 β-κλώνους. Η διάταξη αυτή είναι παρόμοια με την αντίστοιχη κρυσταλλική διαμόρφωση του συμπλόκου.       

Από την άλλη, εντοπίστηκαν μικρές διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων του Ns H-NOX και του συμπλόκου  H-NOX/Cinaciguat. Η πρωτεΐνη H-NOX αποτελείται από 5 α-έλικες και 5 β-κλώνους, σε αντιδιαστολή με τα ευρήματα της μελέτης. Αυτές οι διαφορές οφείλονται στην έλλειψη δομικής πληροφορίας για τα αμινοξέα τα οποία σχηματίζουν την κοιλότητα δέσμευσης της αίμης της Ns H-NOX λόγω της ευκινησίας που προσδίδει η προσθετική ομάδα της αίμης.

Συνολικά, αυτή η μελέτη παρέχει μια εικόνα του συμπλόκου Ns H-NOX /Cinaciguat, μέσω πειραμάτων μοριακής βιολογίας και φασματοσκοπίας NMR. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες που θα επιτρέψουν την ολοκληρωτική επίλυση της δομής και τη δυναμικής του συμπλόκου in vivo. Τέτοια δεδομένα θα συμβάλλουν στον βιοχημικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό του τομέα H-NOX της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης ενώ θα κατευθύνουν το σχεδιασμό και τη σύνθεση νέων δραστικών ενώσεων. H εύρεση της δομής της sGC θα αποτελέσει ορόσημο για την θεραπεία ασθενειών που σχετίζονται με το καρδιαγγειακό σύστημα και θα επιτρέψει την προσέγγιση και θεραπεία τους με καινοτόμο και πιθανώς αποτελεσματικό τρόπο.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

  1. Alexandropoulos II, Argyriou AI, Marousis KD, Topouzis S, Papapetropoulos A, Spyroulias GA (2016). 1H, 13C, 15N backbone and side-chain resonance assignment of Nostoc sp. C139A variant of the heme–nitric oxide/oxygen binding (H-NOX) domain. Biomol NMR Assign 10:395–400. 
  2. Martin F et  al (2010). Structure of cinaciguat (BAY 58–2667) bound to Nostoc H-NOX domain reveals insights into hememimetic activation of the soluble guanylyl cyclase. J Biol Chem 285:22651–22657.
  3. Sandner, Peter Biol Chem. 2018;399(7):679-690.

Corresponding Author: Spyroulias GA